无菌室内的地面、必须平整，不易藏污纳垢，便于清洗。工作台的台面应该处于状态。无菌室和缓冲间都装有紫外线灯，无菌室的紫外线灯距离工作台面 1 米。工作人员进入无菌室应穿灭过菌的服装，戴帽子。
当前无菌室多存在于微生物工厂，一般实验室则使用超净台。超净台其主要功能是利用空气层流装置排除工作台面上部包括微生物在内的各种微小尘埃。通过电动装置使空气通过高效过滤器具后进入工作台面，使台面始终保持在流动无菌空气控制之下。而且在接近外部的一方有一道高速流动的气帘防止外部带菌空气进入。
在条件较困难的地方，也可以用木制无菌箱代替超净台。无菌箱结构简单，便于移动，箱正面开有两个洞，不操作时用推拉式小门挡住，操作时可以将双臂伸进去。正面上部装有玻璃，便于在内部操作，箱内部装有紫外线灯，从侧面小门可以放进去器具和菌种等。
无菌室外源性污染源，主要是通过门和无菌室内外通道侵入的室外空气。因此无菌室的布置通常都采用按照工艺操作的关键程度，洁净度的高低由里往外逐级减弱，抵御室外污染空气的侵入。同时为物料和人员进出无菌室设置相应的控制措施，例如物料的气闸、人员的无菌更衣系统以及室内废弃物传递出来的通道等。无菌室内的污染源，主要来自于无菌室内必要的操作人员和部分工艺设备，通常无菌室内操作人员的四周区域是洁净度最差的区域，也是无菌技术中重要的控制内容。
在无菌室的设计中，通过向室内输送定量的洁净空气，稀释置换室内已使用过的洁净空气，将脏空气排出室外，使室内的空气洁净度等级达到100000级、10000级或局部达到100级的空气洁净度要求，室内已使用过的脏空气由清洁的空气取代，在空气的稀释置换设计中，脏空气与清洁空气持续地混合稀释，逐渐减少房间中的微粒负荷。置换稀释设计对洁净区域的空气净化系统的设计有很高的要求，而且必须考虑无菌室的布局和操作方式，还要为关键区间提供合适的局部单向空气流动保护，需要注意与空气净化系统供应的空气一样，满布高效空气过滤器的单向流动罩产生的空气流动也可以置换稀释房间中空气传播的微粒，这种空气流动会增加有效的房间空气交换率，并有助于污染空气置换稀释。无菌室内空气置换稀释污染系统设计时应注意:洁净空气供应的体积应足以抵消空间中不断产生的微粒数，以此维持工艺操作的基本条件要求;室内空间供应的空气应比普通维持条件下空气更清洁;要求混合供应的清洁空气应满足去除房间内含有微粒的空气，以达到室内空气置换稀释的作用。
无菌室内天花板应与风管、管道、灯具、风口等的安装脱开，光滑、无裂缝，易于清洗。无菌室的门窗材料应选择耐受性好、自然变形小、制造误差小、容易控制缝隙、气密性好的材料，最好采用双层中空玻璃结构的双层窗，既节约空间、又节约能源，还可以避免玻璃窗结露引起霉变，造成污染;窗尽量采用大玻璃，这样可减少积灰点，又有利于清洁工作。
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